高通量測序在病原微生物學方面的研究進展

近年來，隨着測序技術的不斷髮展，實現對大量分離菌高通量，更準確的序列分析，以及對細菌種羣進行高分辨率的系統發育分析，極大地提高了對病原微生物產生、適應和傳播的認識。高通量測序（high throughput generation sequencing，HTS）技術是人類和動物基因組學研究領域中最熱門的話題，與基於Sanger方法的最複雜的毛細管測序儀相比，該技術可以產生的數據多100倍。

與傳統的第一代測序，又稱Sanger測序相比，在DNA測序方面，HTS技術具有快速、廉價和高通量的優點，使得細菌基因組學研究發生了巨大的變化。高通量“台式”測序儀的出現的使實驗室能夠獨立於專業測序中心進行測序工作，同時，HTS高分辨率的特點可以確定病原菌克隆的分子機制，輔助研究人員推斷出全球大流行以及局部暴發期間的傳播途徑，甚至可以對患者個體在感染期間進行細菌種羣進化分析。與傳統的雜交方法相比，HTS還提供了轉錄組分析的潛力，包括覆蓋全基因組範圍及準確定量等，且深度測序輔助對細菌突變體文庫的構建，以確定病原菌在體內生長或在其他特定生長條件下存活所需的決定因素。本文將對HTS在細菌病原體方面的近期研究進展進行闡述。

一、感染過程中細菌進化的研究

感染性疾病的進展和結果往往取決於宿主與病原體如何相互作用，採用HTS技術進行的研究為定殖和感染過程中細菌病原體的進化提供了新的見解。例如，研究發現，在感染過程中，由於選擇性壓力（例如與其他微生物共同感染、宿主的免疫反應及抗生素的應用等），某些固定的亞種中會隨機出現有利與病原菌的突變，同時，在感染期間還可以發生抗生素耐藥性的突變。相較於與傳統的PCR擴增技術和一代Sanger測序，HTS的超基因組學方法可以從微生物羣分析得到更大的多樣性。例如，與健康者相比，肺囊性纖維化患者的微生物多樣性降低與更嚴重的炎症相關，並且微生物的代謝途徑的明顯發生改變。

二、確定疾病暴發的來源和傳播途徑

傳統的細菌分型方法鑑別力較低，無法在傳染病暴發的流行病學調查中發揮精準的作用。全基因組序列可以為分離株之間核苷酸提供最高水平的分辨率，可識別醫院內部和醫院之間以及社區之間的傳播。應用該種新方法可以確定傳播的起源是某單一菌株還是多個菌株共同引起。

三、有助於瞭解病原性克隆出現的分子基礎

對大量緊密相關的分離菌株進行測序可幫助我們重建高分辨率的系統發育樹，有助於對病原菌克隆株出現和傳播的潛在過程進行深入瞭解。例如，基於HTS的進化研究，證明了第七次霍亂大流行由三個獨立事件組成，後兩個是由於霍亂弧菌獲取複方新諾明抗生素耐藥元件造成的，這導致了對常用霍亂治療的失敗引發了流行。

四、HTS在瞭解病原體生物學方面的未來應用

測序技術的飛快發展，單分子測序、讀長不斷的增加使得微生物羣落內單個病原體的高

精度組裝成為了可能。目前細菌培養依然是全基因組測序必不可少的前提條件步驟，但目前已研發出可不經過培養直接檢測標本中微生物的新型方法。這些應用在明確病因不明的感染性疾病中價值巨大。此外，跳過培養的環節，大大節省了樣本週轉時間。

綜上所述，測序技術的發展徹底改變了我們對感染性疾病的研究方式。這種新的技術方法可使人們更加了解微生物病原體的生物學，從而改善感染的情況及最終治癒感染性疾病。